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引加生物的核酸外切酶III（Exonuclease III）來源于大腸桿菌的Exo III基因，并在大腸桿菌中表達并分離純化得到。該酶能作用于雙鏈DNA，沿3′-OH 末端逐步釋放5'-單磷酸核苷酸，產生ssDNA片段。每次酶與底物結合催化時，只有少量核苷酸被去除，從而在DNA分子群內產生漸進缺失。此外，該酶對ssDNA、硫代磷酸酯連接的核苷酸無活性。

盡管該酶也可作用于雙鏈DNA的切刻以產生單鏈缺口，但其最適底物是平末端的dsDNA或3′ 末端凹陷的dsDNA。該酶無法切割3′ 突出末端；抗切割程度隨突出末端的長度而變化，四堿基或更長的突出末端則完全不能被切割。

該酶的活性部分依賴于DNA的螺旋結構，并表現出序列依賴性（C>A=T>G）。溫度、鹽濃度和酶與DNA的比例對酶活性影響很大，需要根據特定應用調整反應條件。

Exo III還具有以下三種酶活性：

3'-磷酸酶活性：切除3'-末端的磷酸基團，產生3'-OH基團；

RNase H活性：外切核酸酶活性，降解RNA-DNA雜合體中的RNA鏈；

AP-內切核酸酶活性：切割脫嘌呤或脫嘧啶位點(AP位點)的磷酸二酯鍵，產生5'-端無堿基的脫氧核糖5'-磷酸殘基。

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